動(dòng)物單細(xì)胞解離的實(shí)質(zhì)

　　破壞掉細(xì)胞間隙維系細(xì)胞關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。在動(dòng)物細(xì)胞解離單細(xì)胞中通常采用膠原蛋白酶和胰蛋白酶來(lái)處理使組織細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，從而制成單細(xì)胞懸液。

　　動(dòng)物單細(xì)胞解離步驟

　　1.文獻(xiàn)資料查詢(xún)，樣本解離方案確定；

　　2.樣品接收（樣品接收時(shí)的溫度檢測(cè)記錄）；

　　3.組織解離器具準(zhǔn)備；

　　4.組織剪切和清洗（去除等，剪切程度）；

　　5.酶液中組織的消化（組織轉(zhuǎn)移，雜交爐，計(jì)時(shí)，中間觀察）；

　　6.離心收集細(xì)胞（離心）；

　　7.去除死細(xì)胞提高細(xì)胞活率；

　　8.自動(dòng)化細(xì)胞技術(shù)儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)/臺(tái)盼藍(lán)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。

　　動(dòng)物細(xì)胞的基本特性

　　1.相較于植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁較為脆弱；

　　2.動(dòng)物細(xì)胞的體積比微生物細(xì)胞大幾千倍，稍小于植物細(xì)胞的體積；

　　3.動(dòng)物細(xì)胞的直徑一般在10μm-30μm；

　　4.大部分動(dòng)物細(xì)胞在肌體內(nèi)相互粘連以集群形式存在。

　　動(dòng)物單細(xì)胞懸液制備心得

　　人-胰腺

　?、瘛⒔怆x

　　該樣品是儲(chǔ)存于組織保護(hù)液中48小時(shí)內(nèi)解離（對(duì)于-80℃儲(chǔ)存的組織解離時(shí)，37℃水浴復(fù)蘇，可邊搖晃邊水浴，盡可能縮短復(fù)蘇時(shí)間，保證組織的較好狀態(tài)）；

　?、?、組織剪切和清洗

　　由圖觀察，該組織塊較大，且組織表面附有血色斑塊物，在組織塊較大能夠保證獲取足量的細(xì)胞前提下可將該部分或明顯贓物去除，減輕后續(xù)除雜壓力，避免多次除雜步驟引起的細(xì)胞損失；組織塊盡量剪碎，可充分被酶液消化；

　　Ⅲ、酶解

　　根據(jù)以往解離經(jīng)驗(yàn)，該組織可采取膠原酶II，37℃酶解（對(duì)于較難消化的組織可采取混合酶消化或提高酶量、消化時(shí)間）；

　?、簟⒂?jì)數(shù)

　　對(duì)于luna細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，在計(jì)數(shù)剛消化下來(lái)的細(xì)胞且背景較高的細(xì)胞，計(jì)數(shù)虛高僅作為參考（且其中細(xì)胞平均粒徑這一參數(shù)很大程度上偏離解離樣本的細(xì)胞粒徑，計(jì)數(shù)越不可信）。

　　酶解1-2小時(shí)后取液染色鏡檢

　　經(jīng)過(guò)除雜處理后的最終細(xì)胞懸液鏡檢圖

　　解離小tips

　　1）現(xiàn)象：剪碎的組織在消化過(guò)程中出現(xiàn)溶液膠狀，組織塊分布在整個(gè)體系中，無(wú)法沉于底部

　　建議：可以加入適量的膠原酶II消化0.5-1小時(shí)

　　2）現(xiàn)象：鏡檢下的細(xì)胞仍存在細(xì)胞間交聯(lián)的情況

　　建議：可加入適量的DNA酶（可將包裹細(xì)胞的基因組進(jìn)行酶解切斷，可改善部分細(xì)胞交聯(lián)現(xiàn)象）

　　3）現(xiàn)象：長(zhǎng)時(shí)間消化仍未鏡檢出細(xì)胞

　　建議：1、保留剩余組織將上清離心然后以小體積重懸再鏡檢（過(guò)大的體積對(duì)于本就細(xì)胞數(shù)不多的情況下，很難鏡檢出細(xì)胞造成無(wú)細(xì)胞的假象）；2、使用膠管反復(fù)用力吹打組織（可能組織已被消化松散，單細(xì)胞仍交聯(lián)在一起）

　　4）現(xiàn)象：待解離組織塊小

　　建議：可采取1.5ml離心管進(jìn)行消化（使酶充分接觸組織、減少試劑用量）

　　5）現(xiàn)象：在使用多種除雜方法后，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀仍呈現(xiàn)出較多背景的情況

　　建議：可使用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，以臺(tái)盼藍(lán)的計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)

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